Southern Blot

Das Southern-Blot-Verfahren wurde im Jahr 1975 von dem britischen Molekularbiologen Edwin Southern entwickelt. Northern Blot und Western Blot, die später erst entwickelt wurden, wurden aufgrund des Namens von Edwin Southern nach den Himmelsrichtungen benannt.

• Behandlung der zu untersuchenden DNA mit Restriktionsendonukleasen
• gelelektrophoretische Auftrennung der einzelnen DNA-Fragmente nach ihrer Größe und Sichtbarmachung mittels Ethidiumbromid^[1]
• Alkalische Spaltung der Doppelstränge durch Einsatz von Alkalien
• Blotting: Übertragung der durch die Elektrophorese hervorgebrachten DNA-Muster auf eine Nitrocellulose- oder PVDF-Membran
• Inkubation der Membran mit einer radioaktiv, chemisch oder fluoreszierend markierten, der gesuchten DNA-Sequenz komplementären, einzelsträngigen DNA oder RNA (= Sonde)
• Entstehung von Basenpaarungen der Sonde mit der gesuchten DNA-Sequenz, die sich durch die Markierung identifizieren lässt.

Zunächst wird die zu analysierende DNA isoliert und anschließend mit spezifischen oder unspezifischen Restriktionsenzymen geschnitten. Danach erfolgt die elektrophoretische Auftrennung in einem Gel und der Transfer auf eine Membran. Für den Transfer existieren verschiedene Methoden.

1. Kapillar-Blot: nutzt die Kapillarkraft, um die DNA mit Hilfe einer Pufferlösung aus dem Gel auf die Membran zu transportieren.
2. Vakuum-Blot: Die Methode funktioniert prinzipiell wie der Kapilarblot. Der Vorgang wird allerdings durch ein Vakuum beschleunigt.
3. Elektro-Blot: Hier geschieht der DNA-Transfer durch das Anlegen einer elektrischen Spannung. Die negativ geladene DNA wandert in einer Elektrolytlösung aus dem Gel in Richtung der hinter der Membran gelegenen Anode.

Nach dem Übertragen der DNA auf die Membran kann die Sondierung durch eine zur DNA komplementären RNA- oder DNA-Sonde erfolgen. Wenn die nicht gebundenen Sonden entfernt sind, kann der eigentliche Nachweis erfolgen. Die Nachweismethode unterscheiden sich je nach Art der Sonde voneinander.