SOLiD-Sequenzierung

• sehr billig
• sehr geringe Fehlerrate
• gut, um SNPs zu identifizieren
• nur sehr kurze Read-Länge (ca. 90 bp)
• sehr lange Laufzeit

SOLiD-Sequenzierung verwendet das Prinzip der zwei-Basen-Sequenzierung. Die Sequenz wird nicht wie bei der Pyrosequenzierung durch Verfolgung der DNA-Synthese ermittelt, sondern durch Sonden, die in regelmäßigem Abständen nacheinander binden und dabei immer zwei Basen identifizieren. Die Sonden tragen eines von vier fluoreszierenden Labeln, das durch einen Laser angeregt und einen Detektor gemessen wird.

Es gibt insgesamt 16 Sonden. Dies entspricht allen Kombinationen, die mit zwei Basen möglich sind (AT, AC, AG, TA etc.). Die Sonde besteht aber nicht nur aus diesen zwei Nukleotiden, sondern außerdem aus drei universellen Nukleotiden, die jede andere Sequenz binden und drei weiteren universellen Nukleotiden, die das fluoreszierende Label tragen. Diese letzten drei werden nach der Messung der Fluoreszenz abgetrennt. Die Sonde hat also folgende Struktur:

• 2 Nukleotide: Binden an den komplementären Strang, wenn diese zwei Nukleotide übereinstimmen
• 3 Nukleotide: Universelle Nukleotide, die mit jedem anderen Nukleotid Basenpaarungen eingehen
• 3 Nukleotide: Ebenfalls universelle Nukleotide. Sie tragen außerdem das Label. Werden danach abgespalten.

Da es 16 Sonden gibt, aber nur vier verschiedene Label, ist nach Bindung einer Sonde noch nicht klar, um welche Sequenz es sich handelt. Daher sind mehrere Runs notwendig, in denen jeweils die Bindung der Sonden um eine Base verschoben ist. Dadurch entstehen überlappende Bereiche, die nicht nur die Sequenz identifizieren, sondern auch eine deutlich geringere Fehlerrate als andere NGS-Methoden besitzen

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Die DNA wird durch mechanische oder biochemische Methoden in kurze Fragmente zerkleinert.

An beide Ende der DNA wird ein Adapter ligiert. Es handelt sich um zwei verschiedene Adapter, die als P1 und P2 bezeichnet werden. Die Sequenz von P1 dient später auch als Bindungsstelle des Primers.

Die Sequenzierung muss für ein starkes Signal an Millionen identischer Kopien eines Fragments gleichzeitig stattfinden. Dazu wird eine Emulsions-PCR (emPCR) durchgeführt. Hier befindet sich ein DNA-Fragment in einem Tropfen einer Flüssigkeit, in dem sich auch alle Reagenzien für die PCR befinden.

In diesem Tropfen liegt das DNA-Fragment jedoch nicht frei vor, sondern ist über seinen Adapter P1 an kleine Kugeln (Beads) gebunden. Nach der PCR tragen die Beads jeweils zahlreiche identische Kopien des DNA-Stückes.

Der Adapter P2 wird nun verwendet, um nur Beads zu verwenden, die DNA-Fragmente tragen (Anreicherung)

Die Sequenzierung besteht aus mehreren Runden, in denen jeweils immer zwei Basen im Abstand aller fünf Nukleotide identifiziert werden. Erst nach mehreren Runden kann so die Sequenz eindeutig ermittelt werden.

1. Runde: Der erste Primer (n) bindet an den Adapter P1. Im weiteren bindet nun eine der 16 Sonden, dessen zwei Nukleotide komplementär sind zu den ersten zwei Nukleotiden der DNA. Eine Ligase verbindet die Sonde. Weitere Sonden können nicht binden, da immer ein freies 3'-OH-Ende benötigt wird. Ein Laser regt das Label an und die Fluoreszenz wird gemessen. Durch ein Enzym wird das Label mit den letzen drei Nukleotiden abgespalten. Die restlichen fünf Nukleotide der Sonde bleiben gebunden.

Nun kann die nächste Sonde binden, deren zwei Basen komplementär zu den nächsten zwei Nukleotiden sind, die auf die erste Sonde folgen. Es bindet nun also im Abstand aller fünf Nukleotide eine Sonde.

2.-5 Runde: Der Vorgang wird wiederholt, aber der Primer wird nun um ein Nukleotid verkürzt (n-1). Dadurch bindet nun eine andere Sonde. Da aber das zweite Nukleotid dieser Sonde mit dem ersten Nukleotid aus Runde 1 überlappt, kann auf die Sequenz geschlossen werden. Da die Sonde fünf Nukleotide lang ist, müssen insgesamt auch fünf Runden stattfinden, bis der komplette Strang überlappendend sequenziert ist. Bei jeder neuen Runde wird ein jeweils kürzerer Primer eingesetzt (bis n-5).

• Voelkerding, K. V., Dames, S. A. & Durtschi, J. D. Next-generation sequencing: from basic research to diagnostics. Clin Chem 55, 641-658, doi:10.1373/clinchem.2008.112789 (2009).
• Anleitung von Applied Biosystems