Next Generation Sequencing

Vorherige Methoden beruhen entweder auf enzymatischen (Sanger-Sequenzierung) oder chemischen (Maxam-Gilbert-Verfahren) Techniken. Dabei werden Abschnitte der DNA sequenziert und untersucht. Um das gesamte menschliche Genom zu sequenzieren, müssten die Ergebnisse vieler Abschnitte zusammengefügt werden, was sowohl arbeits- als auch kostenintensiv ist.

Beim Next generation sequencing verläuft der Prozess mehr oder weniger automatisiert und die Ergebnisse werden parallel zur Sequenzierung erhalten. Zusätzlich können die Ergebnisse mit einem menschlichen Referenzgenom abgeglichen werden. Insgesamt ist das NGS somit schneller und kostengünstiger.^[1]

Das Grundprinzip des NGS basiert auf vier Schritten:^[2]

Im ersten Schritt werden DNA-Fragmente erzeugt, z.B. mit Hilfe von Enzymen oder durch Zentrifugation.^[3]

Im nächsten Schritt werden spezifische Adapter-Oligonukleotide an die Bruchstücke gebunden und so eine "DNA-Bibliothek" erstellt.^[3]

Die DNA-Fragmente werden an feste Reaktionsmedien (zum Beispiel an einen Chip) gebunden und vervielfältigt. Dabei werden Cluster identischer DNA generiert, in denen die eigentliche Sequenzierung abläuft. Durch die Aufteilung in Cluster können in sehr kurzer Zeit viele Sequenzierungen gleichzeitig ablaufen.

Die erhaltenen Daten werden in Form eines DNA-Chips gespeichert und bioinformatisch analysiert. Die Datenmengen können dabei über 200 GB erreichen. Das erschwert die Datenspeicherung und vor allem die -weitergabe an andere Wissenschaftler oder Ärzte. Viele Labors arbeiten daher mit Cloud-Diensten.

Beim NGS existieren verschiedene Verfahren.^[2] Entscheidend für die Auswahl des Verfahrens ist die Coverage. Sie gibt die Mindestanzahl an Reads an, die für die Erstellung einer Referenzsequenz nötig ist. Als Read wird eine zum DNA-Fragment komplementäre Basensequenz bezeichnet. Für das menschliche Genom muss die Coverage über 30 liegen, was derzeit (2020) durch die Illumina- und SOLiD-Sequenzierung gewährleistet ist.

Bei der Pyrosequenzierung werden die DNA-Basen an Pyrophosphat gebunden einzeln zugesetzt. Findet eine Basenpaarung statt, wird das Pyrophosphat frei, das mithilfe einer enzymatischen Reaktion zu Adenosintriphosphat umgewandelt wird. In einem Luciferin-Luciferase-System wird Licht erzeugt, das über einen Detektor erfasst wird.

Die Illumina-Sequenzierung basiert auf dem Prinzip des Sequencing-by-Synthesis. Bei diesem Verfahren sind die Nukleotide an einen Terminator und einen fluoreszierenden Farbstoff gebunden. Die Basenpaarung führt zu Anregung des Farbstoffs, die von einem Detektor registriert wird. Danach wird der Terminator entfernt und neue Nukleotide hinzugefügt.

Die SOLiD-Sequenzierung basiert auf dem Prinzip des Sequencing-by-ligation. Hierbei kommen 16 verschiedene, sogenannte Oligonukleotidsonden zum Einsatz. Jede dieser Sonden trägt einen spezifischen Farbstoff und besteht aus zwei spezifischen und sechs weiteren Basen. An den oben erwähnten Adapter wird ein spezifischer Primer gebunden. Mithilfe einer Ligase wird eine passende Oligonukleotidsonde angelagert. Anschließend wird das Signal des Farbstoffs ausgelesen.

Bei der Halbleitersequenzierung werden die einzelnen DNA-Cluster von einem Halbleiter umgeben, der als pH-Meter dient. Kommt es zu einer Basenpaarung, wird ein Proton freigesetzt. Die daraus resultierende pH-Wert-Änderung wird durch den Halbleiter aufgezeichnet.

Derzeit (2020) wird das Next generation sequencing v.a. zu Forschungszwecken, in der klinischen Genetik, der Mikrobiologie und der Onkologie verwendet.^[1]