T4-Polynukleotidkinase
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LoslegenEnglisch: T4 Polynucleotide kinase, PNK
Definition
Die T4-Polynukleotidkinase, kurz PNK, ist ein Enzym des Bakteriophagen T4. Es kann freie 5'-Enden in der DNA phosphorylieren und Phosphatgruppen vom 3'-Ende abspalten. Als rekombinantes Protein findet es breite Anwendung in der Biotechnologie.
Biochemie
Die T4-Polynukleotidkinase katalysiert die Übertragung des γ-Phosphats von ATP (das äußere Phosphat) auf freie 5' DNA- und RNA-Enden. Außerdem entfernt es Phosphatgruppen vom 3-Ende der DNA oder RNA. Zusätzlich kann es ebenfalls 2'-3' Phosphodiesterbindungen spalten, die in zyklischen Monophosphaten wie cAMP oder cGMP vorkommen. Das Protein ist ein Homotetramer und besteht aus 301 Aminosäuren.[1]
Funktion
Die T4-Polynukleotidkinase kann in Bakterien nachgewiesen werden, die vom T4-Phagen befallenen wurden. Hier dient es der Behinderung der Wirtsabwehrreaktion. Um die Translation von viralen Proteinen zu verhindern, zerschneidet eine bakterielle Anticodon-Nuklease zelluläre tRNA an einer bestimmten Stelle in der Nähe des Anticodons. Zusammen mit einer Ligase repariert die T4-Polynukleotidkinase die geschnitten tRNAs, wodurch die Produktion viraler Proteine fortgesetzt werden kann.[2]
Anwendung in der Biotechnologie
Die T4-Polynukleotidkinase findet breite Anwendung bei der Klonierung von DNA. Soll beispielsweise eine Sequenz in ein Plasmid eingefügt werden, so wird dieses mittels Restriktionsendonukleasen an einer definierten Stelle aufgeschnitten. Um zu verhindern, dass die Enden sich wieder verbinden, werden sie meist durch eine alkalische Phosphatase dephosphoryliert. Das einzufügende Segment wird hingegen durch die T4-Polynukleotidkinase am 5'-Ende phosphoryliert, so dass nur korrekt rekombinierte Plasmide wieder zirkularisieren.[3]
Die T4-Polynukleotidkinase ermöglicht außerdem das Labeling von DNA-Sonden, indem radioaktiv markiertes ATP verwendet wird.
Für diese Anwendungen wird die T4-Polynukleotidkinase als rekombinantes Protein meist in E. coli produziert und später aufgereinigt.
siehe auch: PNKP
Quellen
- ↑ Zhu, H., Smith, P., Wang, L. K. & Shuman, S. Structure-function analysis of the 3' phosphatase component of T4 polynucleotide kinase/phosphatase. Virology 366, 126-136, doi:10.1016/j.virol.2007.03.059 (2007).
- ↑ Amitsur, M., Levitz, R. & Kaufmann, G. Bacteriophage T4 anticodon nuclease, polynucleotide kinase and RNA ligase reprocess the host lysine tRNA. EMBO J 6, 2499-2503 (1987).
- ↑ Wang, L. K., Lima, C. D. & Shuman, S. Structure and mechanism of T4 polynucleotide kinase: an RNA repair enzyme. EMBO J 21, 3873-3880, doi:10.1093/emboj/cdf397 (2002).