Polymerase-Kettenreaktion
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LoslegenAbkürzung für: Polymerase Chain Reaction
Synonym: Polymerase-Kettenreaktion
Definition
Die Polymerase-Kettenreaktion bzw. PCR ist ein enzymabhängiges Verfahren zur Vervielfältigung bestimmter Gen-Sequenzen innerhalb einer vorliegenden DNA-Kette. Sie kommt unter physiologischen Bedingungen bei der Replikation in allen Zellen vor und kann auch gentechnisch für die In vitro-Amplifizierung von Gensequenzen verwendet werden.
In der medizinischen Umgangssprache wird PCR häufig als Synonym für jede auf Nukleinsäure-Untersuchungen beruhende Diagnostik benutzt, auch wenn es sich technisch nicht um eine Polymerase-Kettenreaktion handelt.
Verfahren
Das Verfahren der PCR benötigt eine einzel- oder doppelsträngige DNA-Kette mit zumindest teilweise bekannter Sequenz. Zur Durchführung der Amplifikation sind außerdem zwei Primer-DNAs essentiell, die auf beiden Seiten der Sequenz jeweils an eine der Ketten binden können sowie einzelne Nukleosidtriphosphat-Moleküle und eine hitzestabile Polymerase, die üblicherweise aus Thermus aquaticus (Taq-Polymerase) isoliert wird.
Die PCR wird heute üblicherweise apparativ in einem Thermocycler durchgeführt. Sie läuft in mehreren Schritten ab:
Denaturierung
Durch Erwärmung des Versuchs-Assays auf bis zu 96°C wird die DNA denaturiert, indem die Wasserstoffbrücken zwischen den beiden Ketten der zu vervielfältigenden DNA gespalten werden. Die Nukleinsäure liegt danach einzelsträngig vor.
Primer-Bindung
Beim Annealing bzw. der Primerhybridisierung wird der Versuchsansatz auf ungefähr 55 bis 65°C abgekühlt und die Primer binden jeweils an das 3'-Ende der Gensequenz. Die konkrete Temperatur hängt dabei von der Nukleinsäuresequenz und -länge der verwendeten Primer ab.
Polymerase-Bindung und DNA-Synthese
Während der Elongation synthetisiert die Polymerase bei einer Temperatur von ca. 72°C vom Primer aus in 5'-3'-Richtung den komplementären Strang. Beim ersten Durchgang entstehen Ketten variabler Länge, da die Polymerase nach der Replikation einer zufälligen Anzahl von Basenpaaren die Synthese abbricht.
Erneute Denaturierung
Die neu synthetisierten Ketten werden wieder bei 96°C geschmolzen und ermöglichen eine wiederholte Anlagerung von Primern.
Erneute DNA-Synthese
An alle einzelsträngigen DNA-Moleküle kann die Polymerase erneut ansetzen und Doppelstränge synthetisieren. Dabei entstehen nur an der ursprünglichen DNA wieder Fragmente zufälliger Länge, während bei den synthetisierten Nukleinsäuren die Polymerisation des Gegenstranges am Beginn des ursprünglichen Primers endet.
Repetition des Vorgangs
Der Ablauf von Schmelzen, Primer-Bindung und Synthese kann so lange wiederholt werden, bis die benötigte DNA-Menge hergestellt ist. Dabei entstehen in exponentieller Menge DNA-Fragmente einer bestimmten Länge, die für weitere gentechnische Experimente verwendet werden können.
Anwendungen
Die Anwendungen der PCR sind vielfältig: Sie wird gerichtsmedizinisch bei Abstammungsgutachten oder bei der Analyse von am Tatort gewonnenem genetischem Material (Genetischer Fingerabdruck) ebenso verwendet wie bei der Diagnose von Erbkrankheiten aus Blutproben oder Chorionzottenbiopsie-Material.
In modifizierter Form, zum Beispiel als Realtime-PCR, kann die Menge des genetischen Materials in der Probe quantifiziert werden.
Die für die gentechnische Herstellung von Proteinen benötigte DNA wird heute durch PCR hergestellt.
Daneben lassen sich Bakterien oder Pilze je nach ihrem genetischen Material mit Hilfe von PCR-Reaktionen charakterisieren. Stämme von RNA-Viren lassen sich mit einem abgewandeltem Verfahren, der Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion nachweisen.