Kryofixierung

Kyrofixiertes Material ist in der Regel besser erhalten als chemisch fixiertes Material. Dies gilt nicht nur für zelluläre Strukturen, sondern besonders für den Bereich der immunhistochemischen Nachweismöglichkeiten verschiedener biologischer Substanzen (z.B. Antikörper).

Bei einer zu langsamen Fixierung entstehen Eiskristalle, die eine Beschädigung des Präparats durch das Zerstören verschiedener Zellstrukutren nach sich ziehen. Um Gefrierschäden zu verhindern, sollte man folgende Dinge beachten:

Da die Wärme aus der Mitte des Präparats erst nach außen transportiert werden muss, ist es wichtig, die Probe so klein wie möglich zu halten.

Um den Gefrierpunkt der Probe zu senken, ist eine Zugabe hoher Konzentrationen von Zucker oder Glycerin ratsam. So wird die Bildung von Eiskristallen verhindert. Ein Nachteil ist jedoch, dass sich die Nachweismöglichkeiten histochemischer Substanzen verringert und osmotische Effekte die Probe verändern könnnen.

Durch die Wahl eines möglichst kalten Mediums - z.B. flüssiger Stickstoff (-183°C) oder flüssiges Propan bzw. Ethan - kann die Bildung von Eiskristallen verhindert werden. Zu beachten wäre jedoch der Leidenfrost-Effekt, welcher die Abkühlung durch eine entstehende isolierende Dampfschicht um das Präparat herum extrem verlangsamt.

Bei einer optimalen Kryofixierung liegen die Eiskristalle im amorphen Zustand als verifiziertes Eis vor.

Die Problematik der Eiskristallbildung besteht auch beim Auftauen der Proben. Darum ist eine spezielle Behandlung von kryofixierten Proben notwendig. Im Allgemeinen bieten sich 2 unterschiedliche Methoden an:

• Mikroskopierung im gefrorenen Zustand: Diese Methode erfordert besondere Mikroskope, die über speziell gekühlte Objekttische und Kammern verfügen.
• Gefriersubstitution: Hier wird das Wasser in den gefrorenen Proben durch flüssiges Aceton ersetzt. Da sich Aceton auf bis zu -80°C abkühlen lässt, ohne zu gefrieren, wird es dazu verwendet das Wasser aus den Zellen zu lösen. Dies erfolgt durch ein langsames (über mehrere Tage) Auftauen der Probe und das schrittweise Ersetzen des Wassers durch Aceton. Meist wird ein weiteres Fixiermittel (z.B. Osmium) der Mischung beigegeben, damit eine zeitgleiche Stabilisierung der Probe möglich ist. Ein Nachteil dieser Methode ist die lange Bearbeitungszeit, welche ein zügiges Ergebnis unmöglich macht.

• Immersionsgefriereinrichtungen: Diese Geräte werden vor allem für das einfache und schnelle Kryofixieren von bereits (chemisch) vorfixierten Proben verwendet. Sie liefern vor allem für immunhistochemische Untersuchungen unter dem Lichtmikroskop eine schnelle kryofixierte Probe.
• Metallspiegel-Apparaturen: Durch das plötzliche Aufpressen einer vorgekühlten Metalloberfläche werden die Präparate fixiert.
• Sprühfixierungsapparaturen: Diese Maschinen sind vor allem zum Anfertigen von Kryopräparationen von Zellsuspensionen (Viren, Bakterien, Hefen, pflanzliche und tierische Zellkulturen) geeignet. Kleine Präparate können schnell eingefroren werden und für elektronenmikroskopische Untersuchungen weiterverwendet werden. Anschließend kann eine Kryosubstitution (z.B. mit Kunstharz) erfolgen.
• Hochdruckgefriereinrichtung: Besonders für dicke Gewebestücke geeignet. Durch den hohen Druck (ca. 2.000 bar) wird die Bildung von Eiskristallen bis zu einer Tiefe von ca. 200 Mikrometern verhindert. Das Material kann direkt geschnitten, gefriergebrochen oder in Kunstharz eingebettet werden.